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Jul 24, 2023

VEGF

Molekulare Psychiatrie

Molekulare Psychiatrie (2023)Diesen Artikel zitieren

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Die Aktivierung der angeborenen Immunität im Gehirn ist ein herausragendes Merkmal der Alzheimer-Krankheit (AD). Die vorliegende Studie untersuchte die Regulierung der angeborenen Immunität durch Injektion von Wildtyp-Serum in einem transgenen AD-Mausmodell. Wir fanden heraus, dass die Behandlung mit Wildtyp-Mausserum die Anzahl der Neutrophilen und die Mikroglia-Reaktivität im Gehirn von APP/PS1-Mäusen signifikant reduzierte. In Anlehnung an diesen Effekt führte die Depletion der Neutrophilen durch neutralisierende Ly6G-Antikörper zu einer Verbesserung der AD-Gehirnfunktionen. Die Serum-Proteomanalyse identifizierte den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor A (VEGF-A) und den Chemokin-Liganden 1 (CXC-Motiv) (CXCL1) als in Serumproben angereicherte Faktoren, die für die Migration und Chemotaxis von Neutrophilen, die Migration von Leukozyten und die Chemotaxis von Zellen von entscheidender Bedeutung sind. Exogenes VEGF-A kehrte die durch Amyloid β (Aβ) induzierte Abnahme der Cyclin-abhängigen Kinase 5 (Cdk5) und Zunahme von CXCL1 in vitro um und blockierte die Neutrophileninfiltration in das AD-Gehirn. Die Überexpression von endothelialem Cdk5 übte eine hemmende Wirkung auf CXCL1 und die Neutrophileninfiltration aus und stellte dadurch die Gedächtnisfähigkeiten bei APP/PS1-Mäusen wieder her. Unsere Ergebnisse decken einen bisher unbekannten Zusammenhang zwischen der VEGF-Signalübertragung im Blut und der Infiltration von Neutrophilen auf und unterstützen die gezielte endotheliale Cdk5-Signalübertragung als potenzielle Therapiestrategie für AD.

Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist die häufigste Form der Demenz, von der vor allem ältere Patienten betroffen sind. Amyloid Beta (Aβ) und neurofibrilläre Knäuel (NFTs) im Gehirn sind die wichtigsten pathologischen Merkmale von AD. Zunehmende Hinweise deuten darauf hin, dass Kreislauffaktoren, einschließlich Immunzellen und verwandte Zytokine, mit pathologischen Veränderungen in AD-Mausmodellen verbunden sein könnten [1,2,3,4,5]. Es wurde festgestellt, dass Neutrophile, die am häufigsten vorkommenden angeborenen Leukozyten im peripheren Blut, im Blut von AD-Patienten mit Demenz [6], im Gehirnparenchym von AD-Patienten [7, 8] und in mehreren AD-Mausmodellen erhöht sind [4, 9,10,11]. Darüber hinaus können systemische Faktoren im Blut junger Mäuse die Neurogenese, die synaptische Plastizität und die kognitiven Funktionen bei alternden Mäusen verjüngen [12, 13] und umgekehrt [14], was darauf hindeutet, dass systemische Faktoren eine wichtige Rolle bei der Modulation des Wirtsverhaltens und der Immunität spielen und Gehirnfunktionen [15,16,17]. Daher deuten diese Studien darauf hin, dass die angeborene Immunität, einschließlich Neutrophiler, eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von AD spielen könnte [4, 6, 7, 8, 18]. Es ist jedoch wenig darüber bekannt, wie dieser Mechanismus mit Therapien mit jungem Blut und anderen Therapiestrategien mit zirkulierenden Faktoren zusammenhängt. Darüber hinaus müssen die wichtigsten systemischen Faktoren, die der Homöostase der angeborenen Immunität im AD-Gehirn zugrunde liegen, noch bestimmt werden.

Es wurde gezeigt, dass die Signalübertragung des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors A (VEGF-A) als durch Blut übertragener Faktor an der Eindämmung der AD-bedingten Neurodegeneration und des kognitiven Verfalls beteiligt ist [19,20,21]. Es wurde festgestellt, dass eine unzureichende VEGF-Signalisierung die Alterung mehrerer Organe beeinflusst, einschließlich der Gehirnkognition bei Mäusen, wohingegen eine verstärkte VEGF-Signalisierung einen altersbedingten Kapillarverlust im Gehirn verhindern und die Lebensdauer verlängern kann [22]. VEGF-A kann auch die Hippocampus-Neurogenese bei jungen Mäusen steigern [23, 24] und Signale an die Hippocampus-Endothelzellen senden, die wesentliche Sensoren für altersbedingte Kreislauffaktoren sind [25]. Es wurde festgestellt, dass VEGF den Aβ-induzierten AMPA-Rezeptorverlust verhindert und synaptische Dysfunktionen durch direkte Wirkung auf Synapsen behebt [26].

In dieser Studie haben wir gezeigt, dass die Anzahl der entzündlichen Neutrophilen in der Peripherie und im Gehirn bei APP/PS1-Mäusen nach der Injektion von Wildtyp-Serum verringert war. Wir wollten außerdem die Rolle des endothelialen VEGF-A/Cyclin-abhängigen Kinase 5 (Cdk5)/Chemokin (CXC-Motiv)-Liganden 1 (CXCL1)-Signals im Prozess der Neutrophileninfiltration in das Gehirn von APP/PS1-Mäusen aufdecken. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die gezielte Ausrichtung auf Neutrophile und/oder die Signalübertragung von Transportmolekülen zur Wiederherstellung des Gleichgewichts der Immunmikroumgebung im Gehirn eine vielversprechende Strategie für die AD-Therapie ist.

Acht Monate alte männliche transgene APP/PS1-Mäuse (APPswePSEN1dE9) auf einem C57BL/6-Hintergrund, altersentsprechende Wildtyp-Mäuse (WT) und 4 bis 6 Wochen alte männliche C57BL/6-Mäuse wurden aus dem gewonnen Nanjing Biomedical Research Institute der Universität Nanjing (Nanjing, China). Die Promotoren beider Transgene in den transgenen APP/PS1-Mäusen, die das humane KM670/671L-mutierte APP-Gen und das M146L-mutierte PSEN1-Gen koexprimieren, werden durch das Maus-Prionprotein-Read-Through-Transkript (Prn) kontrolliert. Cx3cr1-GFP-transgene Mäuse (B6.129P-Cx3cr1tm1Litt/J) wurden vom Jackson Laboratory gekauft (Bestellnummer: 005582). Die Tiere wurden unter Verwendung einer intraperitonealen (ip) Injektion von 250 mg/kg Tribromethanol (T48402, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) und 2,5 % tert-Amylalkohol (240486, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) mit einem 0,22-µm-Filter (Millipore, MA, USA) gefiltert, Blut gesammelt und das Gehirn vor der Ernte mit kalter Kochsalzlösung und/oder 4 % PFA perfundiert. Alle Tiere wurden unter kontrollierten Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen gehalten und in einer 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus-Umgebung gehalten. Alle Versuchsprotokolle entsprachen den Vorschriften des Institutional Animal Care and Use Committee der Sun Yat-sen University. Tiere wurden von den Experimenten ausgeschlossen, wenn sie ein offensichtliches krankheitsähnliches Verhalten zeigten, wie z. B. Bewegungslosigkeit in den OFT- und MWM-Tests oder Tod vor oder während der Experimente.

Mäuseserum wurde von jungen männlichen C57BL/6-Mäusen (n = 150; 4–6 Wochen alt) nach retroorbitaler Blutung gesammelt. Aus dem Vollblut wurde nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur und über Nacht bei 4 °C und Zentrifugation bei 4000 × g Serum hergestellt. Gepooltes Mäuseserum wurde durch einen sterilen Spritzenfilter mit einer Porengröße von 0,22 µm (Millipore) filtriert, mit einer Slide-A-Lyzer™-Kassette (Thermo Scientific) dialysiert und dann bei –80 °C gelagert. Acht Monate alte männliche APP/PS1-Mäuse (n = 20) und altersentsprechende WT-Wurfgeschwister (n = 20) wurden systemisch mit 9 Injektionen Serum (200 μl/Injektion) oder einer gleichen Menge sterilem PBS in den Schwanz behandelt Vene alle 3 Tage. Alle Mäuse (ca. 9 Monate alt) wurden 48 Stunden nach dem Angstkonditionierungstest getötet; n = 7–10 für die Verhaltenstests und n = 4–15 für histologische und biochemische Tests [27]. Die Stichprobengröße wurde auf der Grundlage ähnlicher früherer Studien zu AD ausgewählt [3, 4, 10]. Alle Stichproben wurden zufällig Gruppen mit annähernd ausgewogenen Stichprobengrößen zugeordnet.

Die Angstkonditionierung wurde in einer Kammer mit Innenabmessungen von 20 cm Breite × 20 cm Tiefe × 30 cm Höhe (Coulbourn Instruments, USA) durchgeführt. Männliche Mäuse wurden einzeln in die Testkammer gesetzt. Nach einer Basiszeit (192 s) erhielten die Tiere drei Ton-Schock-Paarungen. Der konditionierte Reiz (CS) war ein reiner Ton (20 s Dauer, 4000 Hz, 60 dB), dem unmittelbar ein kontinuierlicher elektrischer Schock folgte, der auf den Gitterboden abgegeben wurde (unkonditionierter Reiz, US: 2 s, 0,5 mA). Auf jede Ton-Schock-Paarung folgte eine Zeitspanne von 64 Sekunden, und nach dem dritten Schock blieben die Mäuse weitere 64 Sekunden im Kontext A. Vierundzwanzig Stunden nach der Konditionierung wurden die Mäuse für 320 Sekunden wieder in die Testkammer gestellt und hinsichtlich der Gefrierzeit bewertet (kontextabhängige Konditionierung). Anschließend wurden die Tiere in eine neue Kammer mit nicht parfümierten Innenwänden aus schwarzem Kunststoff und Einstreu auf dem Boden gebracht und während einer Basisperiode von 192 Sekunden hinsichtlich des Einfrierens bewertet, gefolgt von einer 320-sekündigen Exposition gegenüber einem Ton, der mit dem konditionierten Reiz identisch war (Cued-Konditionierung). ). Das detaillierte Protokoll wurde bereits beschrieben [28].

Der MWM-Test wurde wie zuvor beschrieben mit geringfügigen Modifikationen an männlichen Mäusen durchgeführt [29]. Kurz gesagt, während der Erfassungsphase erhielten die Mäuse einen Trainingsversuch pro Tag, um eine versteckte Plattform 1,0 cm unter der Wasseroberfläche in einem Becken zu lokalisieren, indem sie die deutlichen visuellen Hinweise an der Innenwand des Beckens nutzten. Die maximale Zeit für jeden Versuch betrug 60 s. Eine Maus erreichte die Plattform nicht innerhalb von 60 Sekunden und wurde manuell zur Plattform geführt. Dort blieb sie 10 Sekunden lang, bevor sie in den Käfig zurückgebracht wurde. Das Intervall zwischen den Versuchen betrug für jede Maus 10 Minuten. Während der Sondenphase wurde die Plattform entfernt und die Mäuse erhielten einen einzigen Versuch, der 60 Sekunden dauerte, ohne dass ihnen ein Fluchtweg zur Verfügung stand. Die Schwimmbahnen wurden mit dem Video-Tracking-System TopScanTM 2.0 (Clever Sys., Inc., Reston, VA, USA) aufgezeichnet. Alle Verhaltenstests wurden in der Light-off-Phase zwischen 10:00 und 17:00 Uhr durchgeführt.

Unter tiefer Anästhesie wurden Mäuse transkardial mit kalter, steriler Kochsalzlösung perfundiert und das Gehirn sofort entfernt. Eine Halbkugel wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren und die andere Halbkugel wurde 24 Stunden lang bei 4 °C in 4 % Paraformaldehyd eingetaucht und in 15 % Saccharose in 0,1 M Phosphatpuffer (PB) äquilibriert, gefolgt von 30 % Saccharose. Anschließend wurden 40 μm dicke gefrorene Schnitte des Hippocampus mit einem Leica SM2000R-Gleitmikrotom (Leica Microsystems, Richmond Hill, Ontario, Kanada) gesammelt und bis zur Durchführung der Immunfluoreszenzfärbung bei 4 ° C gelagert. Die Hirnschnitte wurden in einem kontinuierlichen Äquiabstand von fünf koronalen Schnitten im Abstand von 240 μm ausgewählt. Die gefrorenen Halbkugeln wurden homogenisiert und bei 4 °C in RIPA-Puffer (Radioimmunpräzipitationsassay) (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 % Triton X-100, 1 % Natriumdesoxycholat und 0,1 % SDS) extrahiert 1 % Phosphatase- und 1 % Proteaseinhibitoren (Sigma-Aldrich, MO, USA) unter Verwendung eines TissueRuptor-Homogenisators (Qiagen, DUS, Deutschland); Das Homogenat wurde 30 Minuten lang bei 12.000 × g (Eppendorf, HAM, Deutschland) zentrifugiert und der Überstand als RIPA-lösliche Fraktion gesammelt. Das Pellet wurde in 2 % SDS und 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, erneut extrahiert. Der Überstand wurde als SDS-lösliche Fraktion gesammelt.

Die folgenden Primärantikörper wurden verwendet: Maus-Anti-Aβ1-42 (1:1.000; A5213, Sigma-Aldrich), Ratten-Anti-CD68 (1:400; MCA1957, Bio-Rad), Kaninchen-Anti-Iba-1 (1: 1.000; Wako Chemical), Maus-Anti-Glutamat-Rezeptor 1 (1:400; ab183797, Abcam), Maus-Anti-Synaptophysin (1:200; S5768, Sigma-Aldrich), Ratte-Anti-Maus-Ly6G (1:200; BP0075, Bioxcell), Maus-Anti-Myeloperoxidase (MPO, 1:1.000; AF3667-SP, F&E), Maus-Anti-Neutrophilen-Elastase (NE, 1:1.000; MAB4517-SP, F&E), Ratte-Anti-Ki67 (1:500; SolA15 , eBioscience), polyklonaler Kaninchen-Anti-Claudin5-Antikörper (1:400; YT0953, Immunoway), Maus-Anti-pCdk5 (1:400; C-7, Santa Cruz) und Maus-Anti-Cdk5 (1:400; DC 17, Santa Cruz). ). Folgende Sekundärantikörper wurden verwendet: Alexa Fluor 647 Esel Anti-Maus, Alexa Fluor 594 Esel Anti-Ratte, Alexa Fluor 488 Esel Anti-Ziege, Alexa Fluor 555 Ziege Anti-Kaninchen und Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Kaninchen (1: 400, Invitrogen). PE-konjugierte Anti-CD31-Antikörper (1:100; 553373, B&D), FITC-konjugierte Anti-CXCL1-Antikörper (1:100; IC4532G, B&D) und DyLight 649-markiertes Lektin (1:200; L32472, InvitrogenTM) wurden verwendet einige Immunfluoreszenzexperimente. Die detaillierten Immunfluoreszenzprotokolle wurden bereits beschrieben [30].

Ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop LSM 780 oder 800 (Carl Zeiss Microscopy) wurde verwendet, um repräsentative Bilder der Schnitte mit denselben Parametern aufzunehmen, um mögliche technische Artefakte zu vermeiden. Für die mittlere Intensität der Fluoreszenzsignalquantifizierung im interessierenden Bereich in jedem Bild wurde die ImageJ-Software (NIH) verwendet. Zur Analyse der Kolokalisierung in der ergänzenden Abbildung 4: Analyse der Fluoreszenzintensitätsprofilverteilung von Cdk5 und pCdk5 mit CXCL1 unter Verwendung von ZEN 2.3 (Carl Zeiss Microscopy). Öffnen Sie in der detaillierten Beschreibung eine konfokale Fluoreszenzmikroskopie mit ZEN 2.3 (blaue Edition) und wählen Sie „Verarbeitung“ und dann „Profildefinition“. Die Fluoreszenzsignalverteilung kann in Grafiken über dem Pfeil angezeigt werden. Die Liste der Fluoreszenzintensitätsdaten finden Sie in der „Profiltabelle“. Für die 3D-Rekonstruktion wurden die ursprünglichen konfokalen Z-Stapelbilder mit einem 63-fachen Ölimmersionsobjektiv mit digitalem Zoom 2.0 vom LSM 780-Mikroskop aufgenommen. Anschließend wurde die Imaris-Software (Bitplane, Version 8.4) verwendet, um mithilfe des „Oberflächentools“ rekonstruierte 3D-Bilder zu rendern und zu erhalten. Nach der Rekonstruktion wurde ein digitales Zoom-Tool zur Bildvergrößerung verwendet, wie in Abb. 7H (rechts) und I dargestellt. GluA1+-Puncta wurden mit dem „Spot Tool“ gerendert. Verteilte Puncta innerhalb der Mikroglia wurden als verschlungene synaptische Puncta definiert. Der Abstand von der Mikrogliaoberfläche und den außerhalb der Mikroglia verteilten kontaktierten Puncta beträgt weniger als 0 μm, von der Mikrogliaoberfläche beträgt der Abstand jedoch weniger als 0,25 μm.

Für die Analyse peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMC) wurden 200 µl Vollblutproben aus einem anderen Satz von APP/PS1-, APP/PS1 + Serum- und APP/PS1 + Ly6G-Mäusen in 2-ml-Zentrifugenröhrchen mit 1 % Heparin-Natrium gesammelt ( 10 μL). Nach der Antikoagulation wurde die Lösung mit gleicher steriler Kochsalzlösung verdünnt. PBMCs wurden unter Verwendung von Ammoniumchlorid-Kalium (ACK)-Lysepuffer gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert. Die Tiere wurden mit kalter, steriler Kochsalzlösung durchströmt, um das restliche periphere Blut zu entfernen, und die Gehirne wurden entnommen. Die Methode zur Erzeugung von Gehirnimmunzellen wurde in einer früheren Studie mit geringfügigen Modifikationen verwendet [31]. Das Gehirn wurde schnell präpariert und in kalte Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) getaucht. Das Gehirn wurde mit einer Schere zerkleinert und mit einem Dounce-Homogenisator in eiskaltem HBSS 30 Mal blasenfrei homogenisiert. Die Zellsuspension wurde dann in ein vorgekühltes 15-ml-Röhrchen überführt und durch ein vorbefeuchtetes (HBSS) 70-μm-Nylonnetz filtriert. Myelin und Ablagerungen wurden unter Verwendung eines modifizierten kalten 40 % Percoll-Gradienten (Merck Millipore, 17-0891-02) durch 30-minütige Zentrifugation bei 500 × g ohne Beschleunigung oder Bremsen entfernt. Das Pellet aus Immunzellen enthielt Mikroglia, Monozyten und Neutrophile am Boden eines 15-ml-Röhrchens. Die Proben wurden mit FITC-konjugiertem Anti-CD45 (0,25 mg/106 Zellen; 11-0451-81, eBioscience) und PE-Cyn7-konjugiertem Anti-CD11b (0,125 mg/106 Zellen; 25-0112-81, eBioscience) markiert. , APC-konjugiertes Anti-CD62L (0,5 mg/106 Zellen; 553152, B&D), FITC-konjugiertes Anti-CXCR4 (0,5 mg/106 Zellen; 551967, B&D), PE-konjugiertes Anti-Ly6G (0,5 mg/106 Zellen; E-AB-F1108D, Elabscience), EF450-konjugiertes Anti-Ly6C (0,5 mg/106 Zellen; 48-5932-80, Invitrogen), PE-konjugiertes Anti-CD31 (0,25 mg/106 Zellen; B&D, 553373, MEC 13,3 ), BB700-konjugierte Anti-VEGFR2/FLK-1-Antikörper (0,25 mg/106 Zellen; 742184, B&D) und FITC-konjugierte Anti-CXCL1-Antikörper (0,6 mg/106 Zellen; IC4532G, B&D) bei einer Verdünnung von 1:100 für 30 Min. auf Eis. Die experimentellen Proben wurden mit einem Durchflusszytometer (Beckman CytoFLEX S, CA, USA) analysiert.

Die Zytokinprofile des Serums der Gruppen WT + PBS, WT + Serum, APP/PS1 + PBS und APP/PS1 + Serum (n = 1 Mischung aus vier Serumproben) wurden unter Verwendung eines Maus-Zytokin-Antikörper-Arrays (CAT #) analysiert. QAM-CAA-4000; RayBiotech, ATL, USA) und gemäß den experimentellen Protokollen getestet. Eine Kombination von Faktoren, einschließlich der Rangfolge nach Faltungsänderung (<0,67 und >1,5) und Signalintensität (>150), wurde verwendet, um robuste Veränderungen zu identifizieren, und es wurde eine Meta-Rangliste der Proteine ​​erstellt. Die relative Signalintensität der angegebenen Zytokine und Daten zur funktionellen Anreicherung der Gene Ontology (GO) werden in einem Trenddiagramm dargestellt. Das detaillierte Protokoll des Assays unter Verwendung eines Quantibody® Maus-Zytokin-Antikörper-Arrays 4000 wurde bereits zuvor beschrieben [32].

Die Verfahren zur Neutrophilenverarmung wurden bereits beschrieben [4, 10]. Neutrophile wurden 24 Stunden vor der ersten Seruminjektion durch ip-Injektion von 0,3 mg Anti-Maus-Ly6G-Antikörper oder Isotypkontrolle (InVivoPlus Anti-Maus-Ly6G, 1A8; BE0075-1, Bioxcell, NH, USA) alle 3 Tage dezimiert. Die Injektionen von Anti-ly6G-Antikörpern und Serum wurden 4 Wochen lang fortgesetzt, bis Verhaltenstests durchgeführt wurden. Die peripheren Neutrophilenwerte blieben sehr niedrig, was durch einen Immunfluoreszenztest nach Verhaltenstests bestätigt wurde. Das Neutrophilenverfahren wurde kontinuierlich durchgeführt, um mögliche Rebound-Effekte zu vermeiden.

Die Konzentrationen von CXCL1, CCL3, CXCL16, CXCL9, HGF, FetuinA, EGF, FGF2, IL-22, TGFB1 und VEGF-A (Beijing 4A Biotech) sowohl im Serum als auch im Hippocampus wurden wie zuvor beschrieben gemessen [29, 30]. . Blutproben wurden bei 4 °C (15 Minuten bei 4000 × g) zentrifugiert und die Seren in einen anderen Röhrchensatz überführt. Hippocampi wurden in RIPA-Lysepuffer (20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 137 mM NaCl, 1 % NP40, 10 % Glycerin, 1 mM PMSF, 1 μL/ml Aprotinin, 1 μg/ml Leupeptin und 0,5 mM Natrium) homogenisiert Vanadat).

Mikrovaskuläre Endothelzellen des Gehirns von Mäusen (MBECs, bEnd.3, Procell, CL-0598, Wuhan, China) wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers kultiviert. Kurz gesagt, MBECs wurden in 10 % fötalem Rinderserum/Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) und 1 % Penicillin-Streptomycin (Life Technologies, Inc.) in unbeschichteten T75-Kolben bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Alle zwei Tage wurden vollständige Medienwechsel durchgeführt. MBECs wurden unter Verwendung einer Behandlung mit 0,25 % Trypsin 1 Minute lang bei 37 °C passagiert. Insgesamt 10.000 Zellen/cm2 wurden 24 Stunden lang in serumfreiem Medium kultiviert und dann 24 Stunden lang mit Serum (20 μl), Anti-VEGF-A-Antikörper (2 μg) und VEGF-A-Protein (20 ng/ml) behandelt h (CME0014, Beijing 4A Biotech).

Für den CRISPR/Cas9-Knockout des murinen Cdk5-Gens in bEnd.3-Zellen wurden die kleinen Guide-RNAs (sgRNAs) verwendet: sgCDK5#1: CAGGCTGGATGATGACGATG; sgCDK5#2: CCGGGAAACTCATGAGATTG. sgRNA-Sequenzen wurden im NCBI-Online-Tool (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) verifiziert. Die sgRNA-Sequenzen wurden wie zuvor beschrieben in unseren zuvor konstruierten Vektor pSB-CRISPR kloniert (33). Die Effizienz der pSB-CRISPR-Vektorwerkzeuge wurde durch Western Blot mit einem spezifischen Anti-Cdk5-Antikörper identifiziert.

Gesamtproteine ​​wurden aus kultivierten bEnd.3-Zellen und Gehirngeweben unter Verwendung von Proteinlysepuffer (P0013C, Beyotime), der 1 % Phosphataseinhibitoren (Sigma-Aldrich) und 1 % Proteaseinhibitorcocktail (Sigma-Aldrich) enthielt, extrahiert und bei 12.000 × zentrifugiert g (30 Min., 4 °C). Die Gesamtproteinkonzentration wurde mit einem BCA-Protein-Assay-Kit (Beyotime, P0012) bestimmt und auf 3,5 mg/ml eingestellt. Insgesamt 30 μg Protein wurden durch 4–10 % SDS-PAGE abgetrennt und auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran übertragen. Die Membran wurde mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween-20 (TBST), das 5 % Milch enthielt, blockiert und mit monoklonalen Antikörpern gegen Ki67 (1:2.000, SolA15; eBioscience), Cdk5 (1:2.000, DC 17; Santa Cruz) analysiert. p-Cdk5 (1:2.000, C-7; Santa Cruz), Maus-Anti-Glutamat-Rezeptor 1 (1:2000; ab183797, Abcam), Maus-Anti-Synaptophysin (1:2000; S5768, Sigma-Aldrich), Maus-Anti -PSD95 (1:2000; ab13552, Abcam), Gesamt-Tau (D1M9X, 1:2000, 46687, Cell Signaling Technology), Phospho-Tau Ser199/202 (1:2000, AB9674; Sigma-Aldrich) und Kaninchen-Anti-β -Aktin (1:2.000, 4970; Cell Signaling Technology). Die Blots wurden mit dem Image Quant Las4000mini System gescannt. Für die mittlere Intensität der Banden wurde die ImageJ-Software (NIH) verwendet.

APP/PS1-Mäusen wurden 3 Tage lang intraperitoneal 2 μg/kg/Tag rekombinantes Maus-VEGF-A oder Kochsalzlösung injiziert, wie zuvor beschrieben, mit geringfügigen Modifikationen [34]. Systematisch rekombinantes AAV-BR1-CMV-mCdk5-P2A-EGFP (BR1-mCdk5) oder AAV-BR1-CMV-EGFP (BR1-CON) wurde 30 Wochen alten APP/PS1-Mäusen (7,5 Monate alt) durch injiziert Schwanzvene (mCdk5; 1,0 × 1012 genomische Partikel/Maus). Eine weitere Behandlung, beispielsweise eine Seruminjektion, wurde 2 Wochen nach der AAV-Injektion durchgeführt. AAV wurde gemäß früheren Studien durch ein Dreifach-Plasmid-Transfektionssystem hergestellt (35). Kurz gesagt, ein Plasmid enthält das Kapsid BR1, ein zweites Plasmid enthält das ITR-flankierte Cdk5-Gen und ein drittes Plasmid stellt Helfergene bereit.

Primäre Endothelzellen im Hippocampus wurden wie zuvor beschrieben isoliert [36]. Kurz gesagt, Hippocampi von APP/PS1-Mäusen, die mit BR1-mCdk5 oder BR1-CON behandelt wurden, wurden zerkleinert und 30 Minuten lang bei 37 °C mit 2 % (Vol./Vol.) FBS in PBS mit 400 U/ml Kollagenase verdaut. Nach der enzymatischen Verdauung wurde das Gewebe durch 5-minütige Zentrifugation bei 300 × g und 4 ° C pelletiert und der Überstand verworfen. Zellpellets wurden in 2 % (Vol./Vol.) FBS in PBS mit DNase I (0,5 mg/ml) resuspendiert, und Einzelzellsuspensionen wurden vorsichtig auf 22 % Percoll gegeben und bei 560 × g und 4 °C zentrifugiert 10 Minuten, um die Gefäßzellen am Boden des Röhrchens zu erhalten. Gereinigte Zellen wurden auf einem FACS Calibur-Durchflusszytometer (BD influxTM, NJ, USA) unter Verwendung eines Anti-CD31-PE-Antikörpers (0,25 mg/106 Zellen; B&D) analysiert.

Hippocampus-Endothelzellen von Mäusen wurden wie oben beschrieben isoliert [36]. Die Gesamt-RNA aus den Hippocampus-Endothelzellen wurde unter Verwendung von RNAiso Plus (Sangon Biotech, Shanghai, China) isoliert. Die cDNA wurde unter Verwendung eines GoScriptTM cDNA Reverse Transcription Kit (Promega, Madison, WI, USA) synthetisiert. Die Expression spezifischer mRNAs wurde mittels fluoreszenzbasierter quantitativer Echtzeit-PCR (RT-PCR) untersucht. Quantitative PCRs wurden mit TransStart Tip Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech, Peking, China) in dreifacher Ausfertigung für jede Probe durchgeführt. Die Details der Primersequenzen sind wie folgt:

Cdk5 (vorwärts), 59-CAATGCAGAAATACGAGAAACTGG-39;

Cdk5 (rückwärts), 59-CTTTGAGTAGACAGATCTCCCG-39;

Cxcl1 (vorwärts), 59-ACCGAAGTCATAGCCACACTC-39;

Cxcl1 (rückwärts), 59-CTCCGTTACTTGGGGACACC-39.

Die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​wurde mithilfe der Evans-Blau-Färbung, wie zuvor beschrieben, mit geringfügigen Modifikationen beurteilt [30]. Kurz gesagt wurde den APP/PS1-Mäusen einen Tag nach dem letzten VEGF-A eine 2 %ige Lösung des Evans-Blau-Farbstoffs (E2129; Sigma-Aldrich) in 0,9 %iger Kochsalzlösung über die Schwanzvene in einer Dosis von 2 ml/kg intravenös injiziert Injektion. Zwei Stunden später wurden alle Mäuse anästhesiert und transkardial mit kalter 0,9 %iger Kochsalzlösung perfundiert. Um das Austreten von Evans-Blau zu erkennen, wurden Hirngewebeproben in 99 % Dimethylformamid homogenisiert und 48 Stunden lang in einem 50 °C warmen Wasserbad inkubiert. Der Überstand wurde nach Zentrifugation bei 12.000 × g (30 min, 4 °C) gesammelt und die Absorption der Probe bei 620 nm mit einem Mikroplattenlesegerät gemessen.

Koronale Hirnschnitte aus dem Hippocampus (300 μm dick) wurden aus postnatalen 5–6 Monate alten männlichen APP/PS1-Mäusen und ihren WT-Wurfgeschwistern unter Verwendung eines Vibratoms (Leica VT1000) in einer vorgekühlten Lösung mit (in mM) 110 hergestellt Cholinchlorid, 7 MgCl2·6H2O, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2·H2O, 1,3 NaH2PO4, 25 NaHCO3, 20 Glucose, gesättigt mit 95 % O2 und 5 % CO2. Die Schnitte wurden sofort 30 Minuten lang bei 35 °C in künstliche Liquor cerebrospinalis (ACSF) überführt und dann in eine Aufzeichnungskammer überführt. Die Aufzeichnung von ACSF enthält (in mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2·H2O, 1,3 MgCl2·6H2O, 1,3 NaH2PO4, 25 NaHCO3 und 10 Glucose. Alle ACSF-Lösungen müssen vor der Verwendung mit Carbogen (95 % O2/5 % CO2) gesättigt werden, um eine stabile pH-Pufferung (pH 7,3) und eine ausreichende Sauerstoffversorgung zu gewährleisten. Ganzzellige Patch-Clamp-Aufzeichnungen aus dem Soma von Pyramidenneuronen des Gyrus dentatus (DG) wurden unter einem Infrarot (IR)-Differential-Interferenzkontrast-Mikroskop (DIC) (ECLIPSE FN1, Nikon) erhalten. Um mEPSC aufzuzeichnen, wurden die Haltepotentiale bei –70 mV gehalten, der GABAA-Rezeptor und die Aktionspotentiale wurden mit 20 µM Bicucullinmethiodid (BMI) bzw. 1 µM Tetrodotoxin (TTX) blockiert. Glaspipetten wurden mit einer Innenlösung gefüllt, die (in mM) 100 CsMeSO4, 25,5 CsCl, 10 HEPES, 8 NaCl, 0,25 EGTA, 10 Glucose, 4 MgATP und 0,3 Na3GTP (pH 7,3, 285 mOsm) enthielt. Die Daten wurden mit 10 kHz digitalisiert und mit 1 kHz gefiltert und mit einem multiClamp 700B-Verstärker und Digidata 1500B mit pClamp11.2-Software (Molecular Devices) aufgezeichnet. Die Daten wurden gesammelt, wenn der Serienwiderstand innerhalb von 20 % der Anfangswerte schwankte, und mit dem Mini Analysis Program (Synaptosoft) und der Software pClamp 11.2 (Molecular Devices) analysiert. Die Methode der Elektrophysiologie wurde gemäß den zuvor berichteten Studien durchgeführt [37, 38].

Insgesamt 100 µl Vollblutproben von Breittyp-APP/PS1-Mäusen und APP/PS1-Mäusen, denen Serum injiziert worden war, wurden durch Herzpunktion in mit Heparin beschichtete Röhrchen gesammelt. Alle peripheren Blutproben wurden mit einem automatischen Hämatologieanalysator (Sysmex, XT-2000i, Sysmex Corporation, Japan) analysiert. Die folgenden Blutparameter wurden analysiert: Anzahl weißer Blutkörperchen (WBC), Anzahl roter Blutkörperchen (RBC), Neutrophile (Neu), Lymphozyten (Lym), Monozyten (Mon), Eosinophile (Eos), Basophile (Bas), Hämoglobin ( HGB), Hämatokrit (HCT), mittleres korpuskuläres Volumen (MCV), mittleres korpuskuläres Hämoglobin (MCH), mittlere korpuskuläre Hämoglobinkonzentration (MCHC), Thrombozytenzahl (PLT), mittleres Thrombozytenvolumen (MPV), Thrombozytenverteilungsbreite (PDW).

Alle Ergebnisse stammen aus mindestens drei unabhängigen Experimenten und werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Zur statistischen Analyse wurde ein ungepaarter zweiseitiger Student-t-Test (zwischen zwei Gruppen) oder eine einfaktorielle oder zweifaktorielle ANOVA (Bonferroni- oder LSD-Vergleichstests) oder ein Kolmogorov-Smirnov-Test durchgeführt. In den MWM-Testergebnissen wurde eine zweifach wiederholte ANOVA durchgeführt. Für die hämatologische Profilanalyse wurde eine Einweg-ANOVA (gleiche Varianzhomogenität) oder Dunnett T3 (ungleiche Varianzhomogenität) verwendet. Es wurde davon ausgegangen, dass die Datenverteilung normal ist; Dies wurde auch mit QQ-Plots oder Histogrammen getestet. Analyse und grafische Darstellung wurden mit GraphPad Prism Version 8.0 (GraphPad 8.0) durchgeführt. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Die angeborene Immunität ist mit der AD-Pathologie verbunden [39,40,41]. Um die Reaktion angeborener Immunzellen auf die Behandlung mit Wildtyp-Serum bei APP/PS1-Mäusen zu untersuchen, verwendeten wir Durchflusszytometrie, um die Aktivitäten von CD45+- und CD45+/CD11b+-Immunzell-Untergruppen in mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs, Abb. 1A, B; Ergänzung) zu analysieren Abb. 1A, B) und Gehirnzellsuspensionen (Abb. 1G, H). Interessanterweise kam es nach der Serumbehandlung zu einem Anstieg der Anzahl der CD45+-Immunzellen, aber zu einem Rückgang der CD11b+Ly6GhiLy6Clo-Neutrophilen, sowohl im peripheren Blut (Abb. 1C, D, F) als auch im Gehirn (Abb. 1I, J, L) im Krankheitsmodell. Bemerkenswerterweise erhöhte die Seruminjektion die Zellzahl der CD11b+/Ly6Chi/Ly6Glo-Monozyten signifikant (Abb. 1C, E), was mit den Ergebnissen von CD11b+/CD45hi (ergänzende Abb. 1B, C) übereinstimmt. Unerwarteterweise beobachteten wir inkonsistente Ergebnisse zwischen der Anzahl der CD11b+/Ly6Chi/Ly6Glo-Monozyten (Abb. 1I, K) und der CD11b+/CD45hi-Monozyten (ergänzende Abb. 1E, F) in serumbehandelten APP/PS1-Mausgehirnen. Angesichts der Tatsache, dass Neutrophile extrazelluläre Neutrophilenfallen (NETs) produzieren können, analysierten wir das Vorhandensein von NETs im Gehirn von AD-Mäusen durch Immunfluoreszenzfärbung mit Anti-Neutrophilen-Elastase (NE) oder Anti-Myeloperoxidase (MPO). Tatsächlich beobachteten wir Neutrophile, begleitet von NETs im Parenchym, die hauptsächlich um den Hirnventrikel, den Plexus choroideus, die Leptomeningen, die Aβ-Plaque und die kortikalen Gefäße lokalisiert sind (Abb. 2A – D). Konsequenterweise wurden durch die Behandlung mit Ly6G-Antikörpern NE+- oder MPO+-Neutrophile neben dem Hippocampus, den ventrikulären Räumen und den Leptomeningen bei AD-Mäusen abgeschafft (Abb. 2E, F). Als nächstes untersuchten wir den Phänotyp infiltrierender Neutrophilen in einem AD-Mausmodell mittels Durchflusszytometrieanalyse. Die Anzahl der schädlichen hyperreaktiven Ly6G+/CXCR4hi/CD62Llo seneszenten Neutrophilen-Untergruppen war im Gehirn von APP/PS1-Mäusen im Vergleich zu WT-Kontrollen signifikant erhöht, wohingegen diese Effekte durch Behandlung mit Serum oder neutralisierenden Ly6G-Antikörpern verhindert wurden (Abb. 2G, H). Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass die Seruminjektion bei AD-Mäusen die Anzahl der peripheren Neutrophilen verringerte und die Migration hyperreaktiver Neutrophilen-Untergruppen in das Gehirn verhinderte.

Durchflusszytometrie-Sortier-Gating-Strategie von Immunzellen (P1), Einzelzellen (P2), CD45+-Leukozyten (P3) und CD45hi/CD11b+-Monozyten (P4) in PBMCs (A, B) und im Gehirn (G, H). Die roten Pfeile in AB und GH stellen die P2-Teilmenge basierend auf P1, die P3-Teilmenge basierend auf P2 und die P4-Teilmenge basierend auf P3 dar. C-Monozyten weisen aufgrund der Ly6C- und Ly6G-Expression deutlich unterschiedliche Populationen auf. D–F Durchflusszytometrieanalyse der Frequenzen von CD45+-Leukozyten (P3), Ly6Chi/Ly6Glo-Monozyten (angezeigt durch das blaue Tor in C) und Ly6Ghi/Ly6Clo-Neutrophilen (angezeigt durch das rote Tor in C) in den PBMCs von PBS- und Serum -behandelte APP/PS1-Mäuse. I-Monozyten weisen aufgrund der Ly6C-Expression deutlich unterschiedliche Populationen auf. J–L Durchflusszytometrie-Analyse der Häufigkeiten von CD45+-Leukozyten (P3), Ly6Chi/Ly6Glo-Monozyten (angezeigt durch das blaue Tor in I) und Ly6Clo/Ly6Ghi-Neutrophilen (angezeigt durch das rote Tor in I) in den Gehirnen von PBS- und mit Serum behandelte 8–9 Monate alte APP/PS1-Mäuse (Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt; ungepaarter zweiseitiger t-Test nach Student, *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 ; n = 5–6 pro Gruppe).

Repräsentative konfokale Bilder von NE+-Leukozyten (roten Blutkörperchen) im 3V (A), um den Hippocampusbereich (linke Felder in B) und den Plexus choroideus (rechte Felder in B). MPO+-Leukozyten (rote Blutkörperchen) in den Hirnhäuten und im Parenchym, wo sich Aβ-Plaque (grüne Färbung) ablagert (C) und um Gehirngefäße (rechte Bilder in D) bei 8 bis 9 Monate alten APP/PS1-Mäusen. Die Hirngefäße wurden anhand der Hoechst-3D-Färbung mithilfe der Zen-Software identifiziert. Quantifizierung der Anzahl von NE+ (E)- und MPO+ (F)-Zellen im Hippocampus, 3V, Blutgefäßen und Pia Mater in APP/PS1-Mäusen, die mit Anti-Ly6G-Antikörper oder Isotyp-Kontrollantikörper behandelt wurden (Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt). ; ungepaarter zweiseitiger t-Test nach Student, n = 5–6; **p < 0,01; ***p < 0,001). G, H Durchflusszytometrieanalyse von hyperreaktiven Neutrophilen, die das Gehirn infiltrieren, wie sich in der CXCR4hi/CD62Llo-Färbung in APP/PS1-Mäusen widerspiegelt, die mit Serum oder Anti-Ly6G-Antikörper und WT-Kontrollen behandelt wurden (n = 4–5). Einfaktorielle ANOVA, gefolgt von Bonferroni-Mehrfachvergleichstests. ***p < 0,001. Hippocampus, 3V dritter Ventrikel, DG Gyrus dentatus, CP Plexus choroideus, Maßstabsbalken: 20 μm in A und B; 50 μm in C und D.

Die zirkulierende Immunmikroumgebung spielt eine wichtige Rolle bei der zerebralen Homöostase bei AD [40,41,42]. Wir haben gezeigt, dass die Seruminjektion die Anzahl peripherer und zerebraler Neutrophilen in transgenen APP/PS1-Mäusen verringert. Es bleibt jedoch unklar, wie reduzierte periphere Neutrophile ihre Infiltration in das Parenchym bei AD-Mäusen abschwächen können. Daher analysierten wir zunächst die Zytokinprofile des Serums von WT + PBS-, WT + Serum-, APP/PS1 + PBS- und APP/PS1 + Serum-Mäusen mithilfe eines Maus-Zytokin-Arrays. Unbeaufsichtigte hierarchische Clusterbildung basierend auf differentiell exprimierten Proteinen (DEPs) deutete auf ein ausgeprägtes Proteinexpressionsnetzwerk hin, das durch Serum induziert wurde (Abb. 3A, B). Die 82 am besten bewerteten Proteine ​​sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. Die Analyse der Genontologie (GO) zeigte eine signifikante Anreicherung von Proteinen, die hauptsächlich an der Migration von Neutrophilen, Leukozyten und Chemotaxis beteiligt sind (Abb. 3C, D). Die Analyse der Kyoto-Enzyklopädie der Gene und Genome (KEGG) unter Verwendung der 82 am besten bewerteten Proteine ​​(23 herunterregulierte und 59 hochregulierte) ergab ein Netzwerk von Zytokin-Zytokinrezeptor-Wechselwirkungen und Chemokin-Signalwegen (ergänzende Abbildung 2A, B).

Die Maus-Zytokin-Antikörper-Array-Analyse wurde im Serum von mit PBS oder Serum behandelten APP/PS1-Mäusen (8–9 Monate alt) und mit PBS oder Serum behandelten altersentsprechenden WT-Mäusen durchgeführt. A, B Herunterregulierte (blau) und unregulierte (rot) Zytokinexpression wurden im Serum zwischen WT + PBS- und APP/PS1 + PBS-Mäusen sowie zwischen APP/PS1 + PBS- und APP/PS1+Serum-Mäusen nachgewiesen. Genontologie-Anreicherungsanalyse (biologischer Prozess) von 23 herunterregulierten Zytokinen (C) und 59 hochregulierten Zytokinen (D) in den Gruppen APP/PS1+Serum vs. APP/PS1 + PBS. E-Venn-Diagramm, das die überlappenden Zytokine im Serum der vier Gruppen zeigt. Blau stellt die Gruppen APP/PS1 + PBS vs. WT + PBS dar; Rot stellt die Gruppen APP/PS1 + Serum vs. WT + PBS dar; und Grün stellt die Gruppen APP/PS1 + Serum vs. APP/PS1 + PBS dar. F Unbeaufsichtigte Clustering-Genexpressions-Heatmap-Analyse, die die 36 überlappenden Zytokine im Serum von WT + PBS-, WT + Serum-, APP/PS1 + PBS- und APP/PS1 + Serum-Mäusen zeigt.

Darüber hinaus wurden 36 DEPs (Ergänzungstabelle 2) im Serum von WT + PBS-, WT + Serum-, APP/PS1 + PBS- und APP/PS1 + Serum-Mäusen durch ein Venn-Diagramm (Abb. 3E) und eine Heatmap (Abb. 3F). Chemokine, Wachstumsfaktoren und Zytokine wurden aus den 36 DEPs identifiziert, darunter CXCL1, CCL3, CXCL16, CXCL9, HGF, FetuinA, EGF, FGF2, IL-22 und TGFB1. Diese Faktoren sind maßgeblich an der Neutrophilen-/Leukozytenmigration und Chemotaxis beteiligt. Wir haben die Ergebnisse außerdem mithilfe von ELISA-Kits im Serum und Gehirn von WT + PBS-, APP/PS1 + PBS- und APP/PS1 + Serum-Mäusen bestätigt (Abb. 4A – J).

Unsere Daten zeigten, dass die Konzentrationen von CXCL1 (A), CCL3 (B), CXCL16 (C) und FetuinA (F) signifikant erhöht und die Konzentrationen von CXCL9, HGF, IL-22 und TGFB1 im Serum signifikant verringert waren von APP/PS1-Mäusen (8–9 Monate alt) im Vergleich zu denen der altersentsprechenden WT-Mäuse (D, E, I und J). Diese erhöhten Veränderungen wurden jedoch nach der Serumbehandlung auf die bei WT + PBS-Mäusen festgestellten Werte wiederhergestellt. Im Serum von WT + PBS-, APP/PS1 + PBS- und APP/PS1+Serum-Mäusen (G, H) wurden keine offensichtlichen Unterschiede in den EGF- und FGF2-Spiegeln festgestellt. K Protein-Protein-Interaktion (PPI)-Netzwerk basierend auf dem Online-Tool STRING unter Verwendung der 82 am besten bewerteten Proteine ​​erzeugte das stärkste Netzwerk rund um die chemotaktische Zytokin- und angiogene Faktorsignalisierung (CXCL1 und VEGF-A). Die mittleren Konzentrationen werden in pg/ml Serum ausgedrückt. Einfaktorielle ANOVA, gefolgt von Bonferroni-Mehrfachvergleichstests. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. ns nicht signifikant; n = 6 pro Gruppe; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001.

In Übereinstimmung mit den Ergebnissen des Zytokin-Antikörper-Array-Tests waren die Spiegel der Chemokine CXCL1, CCL3 und CXCL16, die mit der Neutrophilenmigration assoziiert sind, im Gehirn von APP/PS1 + PBS-Mäusen signifikant erhöht. Nach einer 4–6 Wochen alten Behandlung mit Wildtyp-Serum normalisierte sich die erhöhte Expression dieser drei Chemokine sowohl in der Peripherie als auch im Gehirn und erreichte die Werte von altersentsprechenden (9 Monate alten) WT-Mäusen (Abb. 4A– C; Ergänzende Abb. 3A–C). Bemerkenswert ist, dass die Ingenuity Pathway Analysis (IPA) unter Verwendung der am höchsten bewerteten Proteine ​​das stärkste Netzwerk rund um die CXCL1- und VEGF-A-Signalisierung erzeugte (Abb. 4K). Darüber hinaus führten wir den Test mit einem Hämatologie-Analysegerät an Wide-Type-Mäusen, APP/PS1-Mäusen, die mit oder ohne Serum behandelt wurden, durch. In Übereinstimmung mit den Daten in Durchflusszytometrietests (Abb. 1E; Abb. S1C) zeigten hämatologische Daten, dass die Seruminjektion die Anzahl der Neutrophilen signifikant verringerte und die Monozytenzahl erhöhte (Ergänzungstabelle 3). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass systemisch zirkulierende Chemokine aus Serum die proinflammatorische Neutrophileninfiltration in das Gehirn in einem AD-Mausmodell modulieren können.

Als nächstes untersuchten wir den molekularen Mechanismus, der der Adhäsion/Infiltration von Neutrophilen bei APP/PS1-Mäusen zugrunde liegt. Wir konzentrierten uns auf das Zytokin CXCL1, ein Neutrophilen-lockendes Chemokin bei ischämischem Schlaganfall [43], Multipler Sklerose [44] und mehreren murinen Modellen der Neuroinflammation [45,46,47]. Der endothelspezifische Cdk5-Knockout erhöhte die CXCL1-Expression und führte zu einer fortschreitenden Astrogliose bei Epilepsie [48]. In Übereinstimmung mit der vorherigen Studie fanden wir eine negative Beziehung zwischen CXCL1-Spiegeln und Cdk5/pCdk5-Spiegeln in bEnd.3-Zellen nach Aβ- oder Serumbehandlung (Abb. 5A; ergänzende Abb. 4A, B). Die Kolokalisierungsanalyse bestätigte, dass die Proteine ​​Cdk5, pCdk5 und CXCL1 im Zytoplasma von mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns vorhanden waren (ergänzende Abbildungen 4C, D). Die Cdk5- und pCdk5-Verteilung unterschied sich jedoch offensichtlich von der CXCL1-Verteilung im Zytoplasma (ergänzende Abbildung 4E, F).

A Repräsentative Bilder der CDK-, pCDK- und CXCL1-Expression in bEnd.3-Zellen (CD31+). Maßstabsbalken: 10 μm. B Western Blot (WB) für die Zellproliferationsmarker Ki67, phosphoryliertes Cdk5 und Cdk5 in bEnd.3-Zellen wurden mit Aβ (2 μM), Serum (20 μl), Anti-VEGF-A-Antikörpern (2 μg) und behandelt rekombinantes VEGF-A-Protein (20 ng/ml). C Quantifizierung der Bande für Ki67-, pCdk5- und Cdk5-Proteine ​​mittels Western-Blot-Analyse; n = 5 pro Gruppe. D ELISA-Analyse für CXCL1-Spiegel im Zusammenhang mit C im Überstand; n = 6 pro Gruppe. E Cdk5-Inhibitor Roscovitin (20 μM) hemmt die VEGF-A-induzierte Cdk5-Phosphorylierung in bEnd.3-Zellen; n = 3–4 pro Gruppe. F Wirkung des CDK5-Knockouts unter Verwendung einer sgRNA auf die CXCL1-Expression in bEnd.3-Zellen mit oder ohne VEGF-A-Stimulation; n = 6 pro Gruppe. G, H Repräsentative Bilder und Quantifizierung der zerebralen Angiogenese (Lectin+) in WT, APP/PS1-Mäusen, APP/PS1-Mäusen, die mit Anti-Ly6G-Antikörpern oder rekombinantem VEGF-A-Protein behandelt wurden; n = 8 Mäuse pro Gruppe, 12 Bildfelder aus 5 Gehirnschnitten pro Tier wurden analysiert und als Wert gemittelt; Maßstabsbalken: 50 μm in G. I–J Repräsentative Bilder und Quantifizierung der durch Anti-MPO-Antikörper gefärbten Neutrophilenadhäsion in kortikalen Kapillaren in APP/PS1-Mäusen (weiß bilinear; die Gefäße wurden anhand des Z-Stack-Tools identifiziert); einfaktorielle ANOVA, gefolgt von Bonferroni-Mehrfachvergleichstests. ns nicht signifikant; n = 6 Mäuse pro Gruppe, 10 Bildfelder aus 4 Gehirnschnitten pro Tier wurden analysiert und als Wert gemittelt; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 für alle. Maßstabsbalken: 20 μm in I. Die drei separaten In-vitro-Experimente, die zu vergleichbaren Ergebnissen führten, sind in den Daten dargestellt.

Darüber hinaus stellten wir fest, dass VEGF-A nach der Serumbehandlung ein weiteres Schlüsselmolekül von IPA war (Abb. 4K) und dass die Serumexposition die zirkulierenden VEGF-A-Spiegel bei APP/PS1-Mäusen erhöhte (ergänzende Abb. 5). Darüber hinaus moduliert die VEGF-A-Signalübertragung die Gehirnfunktionen im Alterungsprozess [22]. Die Hemmung oder Stummschaltung von Cdk5 reduzierte die Migration und Angiogenese von Endothelzellen durch Eingriff in das Aktin-Zytoskelett [49, 50]. Unsere Daten zeigten übereinstimmend, dass eine verminderte Endothelzellproliferation mit der geringen Expression von Cdk5 nach Aβ-Behandlung in vitro einherging (Abb. 5B, C), was auf einen möglichen Zusammenhang zwischen Cdk5 und Angiogenese schließen lässt. Daher nehmen wir an, dass VEGF-A die CXCL1-Expression über die Cdk5-Signalisierung beeinflussen könnte. Erstens stellten wir fest, dass das Serum die Aβ-induzierte Abnahme der Cdk5-Expression und Phosphorylierung in bEnd.3-Zellen nach der Behandlung mit VEGF-A-Antikörpern nicht verhindern konnte (Abb. 5B, C). Ähnlich wie die vorteilhaften Wirkungen des Serums verhinderte VEGF-A auch signifikant den Aβ-induzierten Anstieg der CXCL1-Expression (Abb. 5D). Um weiter zu untersuchen, wie VEGF-A eine niedrige CXCL1-Expression vermittelte, untersuchten wir die Cdk5-Aktivität unter Verwendung von Roscovitin, einem Inhibitor von Cdk5 (Abb. 5E). Wir fanden heraus, dass Roscovitin die hemmende Wirkung von VEGF-A auf die CXCL1-Expression abschwächte (ergänzende Abbildung 6A – G). In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen verhinderte der Knockout des endothelialen Cdk5-Gens in bEnd.3-Zellen mittels CRISPR-Cas9-Genbearbeitung auch die VEGF-A-vermittelte CXCL1-Unterdrückung und induzierte stattdessen einen dreifachen Anstieg der CXCL1-Spiegel im Überstand (Abb. 5F).

Die Adhäsion von Neutrophilen in Gehirnkapillaren verringert den kortikalen Blutfluss, was zu Gefäßanomalien führt und die Gehirnpathologie in mehreren Mausmodellen der Alzheimer-Krankheit verschlimmert [10, 11]. Wir beobachteten, dass Serum die Angiogenese förderte und die Kapillarsegmente bei APP/PS1-Mäusen verringerte (Abb. 5G, H). Um die Rolle der Neutrophilenadhäsion in kortikalen Kapillaren zu untersuchen, verabreichten wir neutralisierende Ly6G-Antikörper, um periphere Neutrophile in APP/PS1-Mäusen abzubauen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass der Ly6G-Antikörper die vorteilhaften Wirkungen von Serum nachahmte, indem er die Anzahl der Kapillaren erhöhte (Abb. 5G, H). Tatsächlich führte die Behandlung mit Ly6G-Antikörpern zu einer etwa 90-prozentigen Reduzierung der Anzahl der MPO+-Neutrophilen neben kortikalen Kapillaren (Abb. 5I, J; Abb. 2D, F). Diese Daten deuten darauf hin, dass Serum die Kapillardichte im Gehirn erhöhen kann, indem es die Adhäsion/Infiltration von Neutrophilen verhindert.

Als nächstes testeten wir die Hypothese, dass aus Serum gewonnenes VEGF-A für die Blockade der Neutrophilenadhäsion und des Hirnkapillarverlusts in vivo notwendig ist. Daher haben wir rekombinantes VEGF-A-Protein auf APP/PS1-Mäuse angewendet und festgestellt, dass VEGF-A die Aktivität von Cdk5 und pCdk5 fördern (ergänzende Abbildungen 7A–F, I–N), die Angiogenese des Gehirns erhöhen und winzige Kapillarsegmente verringern kann (Abb. 5G, H), gefolgt von einer Abnahme der Neutrophilenadhäsion bei APP/PS1-Mäusen (Abb. 5I, J). In ähnlicher Weise zeigte der neutralisierende Antikörper Ly6G ähnliche Vorteile wie Serum und VEGF-A-Protein hinsichtlich der Anzahl der Kapillaren und der Adhäsion von Neutrophilen neben kortikalen Kapillaren (Abb. 5I, J). Bemerkenswerterweise beobachteten wir keine zusätzliche Verschlechterung der BHS-Permeabilität und -Integrität im Gehirn von VEGF-A-behandelten APP/PS1-Mäusen im Vergleich zu PBS-behandelten APP/PS1-Mäusen (ergänzende Abbildung 8A – C). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass aus Serum gewonnenes VEGF-A die CXCL1-Expression über die Cdk5-Aktivität unterdrückt, was zur Hemmung der Neutrophilenrekrutierung im Gehirn von AD-Mäusen führt.

Um die Rolle wandernder Neutrophiler im Gehirn bei kognitiven Beeinträchtigungen zu bestimmen, bewerteten wir anschließend das räumliche Lernen und die Gedächtnisleistung mithilfe kontextueller Angstkonditionierung und Morris-Wasserlabyrinth-Tests. Während des Angstkonditionierungstrainings zeigten alle Gruppen eine vergleichbare Grundeinfrierzeit (ergänzende Abbildung 9A). Wir fanden jedoch heraus, dass das Einfrierverhalten während des kontextuellen (ergänzende Abbildung 9B), aber nicht ausgelösten (ergänzende Abbildung 9C) Angstgedächtnistests bei APP/PS1-Mäusen nach der Erschöpfung der Neutrophilen signifikant zunahm. Die Leistung war ähnlich der von WT-Mäusen und serumbehandelten APP/PS1-Mäusen (ergänzende Abbildung 9B). Im MWM-Test verbesserte die Verabreichung von Ly6G-Antikörpern an APP/PS1-Mäuse auch die Leistung bei der Lokalisierung versteckter Plattformen während der Erfassungsphase (ergänzende Abbildung 9D). Während der räumlichen Sondenphase verbrachten APP/PS1-Mäuse mit Neutrophilenmangel mehr Zeit und legten größere Distanzen im Zielquadranten zurück (ergänzende Abb. 9E, F; Anstieg von 46,7 % bzw. 53,4 % für Zeit und Distanz im Quadranten) und hatten eine deutlich größere Anzahl von Durchgängen über die Plattform als die APP/PS1-Mäuse (ergänzende Abbildung 9G; 2-fache Steigerung). Darüber hinaus konnten wir keine offensichtlichen Unterschiede in der Schwimmgeschwindigkeit aller Gruppen beobachten (ergänzende Abbildung 9H). Die Löscheffizienz im peripheren Blut, im Gehirn und in den Hirnhäuten wurde durch Durchflusszytometrieanalyse und Immunfluoreszenzfärbung bestätigt (Abb. 2A – F; ergänzende Abb. 10A – F; ergänzende Abb. 11A – E). Die Verabreichung des Ly6G-Antikörpers hatte jedoch keinen Einfluss auf den Prozentsatz der CD3+-T-Lymphozyten (ergänzende Abbildung 11F–I) oder den Gesundheitszustand bei APP/PS1-Mäusen, was sich in den Erkundungsfähigkeiten und der Bewegungsgeschwindigkeit im OFT widerspiegelt (ergänzende Abbildung). . 11J–L). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Behandlung mit dem Ly6G-Antikörper positive Auswirkungen auf das Gedächtnisverhalten von APP/PS1-Mäusen hat.

Um die Rolle der Cdk5-Signalübertragung bei der Neutrophileninfiltration und Gedächtnisdefiziten im APP/PS1-Gehirn weiter zu bestimmen, verwendeten wir AAV2-BR1-CMV-mCdk5-P2A-EGFP (BR1-mCdk5), um eine endotheliale Cdk5-Überexpression im Gehirn zu induzieren, und führten die Verhaltensanalyse durch Test nach dem experimentellen Schema (Abb. 6A–D). RT-PCR bestätigte, dass die Cdk5-mRNA in Hirnendothelzellen nach der AAV-Abgabe erhöht war (Abb. 6E, F). Ähnliche Erhöhungen der Cdk5-Proteinspiegel wurden im Hippocampus mittels Immunfluoreszenzfärbung beobachtet (ergänzende Abbildungen 12A, B).

Ein Schema der experimentellen Details. Die systematische AAV-mCdk5-Expression wurde in 30 Wochen alten (ca. 7,5 Monate alten) APP/PS1-Mäusen bestimmt. Nach 2 Wochen (im Alter von 8 Monaten) wurden mit AAV behandelte männliche transgene APP/PS1-Mäuse neunmal alle 3 Tage 200 μl Serum von 4 Wochen alten C57BL/6-Mäusen intravenös injiziert. Nach der letzten Seruminjektion wurden Verhaltensanalysen durchgeführt, darunter Angstkonditionierungstests (FCT) und der MWM-Test. Schematische Darstellung von AAV2-BR1-Konstrukten mit Angabe der invertierten terminalen Wiederholungen (ITRs) an beiden Enden und CMV-Promotor-gesteuertem mCdk5 mit EGFP (BR1-mCdk5) oder CMV-Promotor-gesteuertem EGFP (BR1-CON). B–D Schematische Darstellung des Angstkonditionierungsverfahrens. B Schulungstag (Kontext I); C Kontextueller Testtag (Kontext I); D Cued-Testtag (Kontext II). E, F Die relativen mRNA-Spiegel von Cdk5 und CXCL1 in primären Endothelzellen aus den Hippocampi wurden in BR1-mCdk5- und BR1-CON-injizierten APP/PS1-Mäusen im Alter von 32 Wochen (n = 4 pro Gruppe) bewertet. Repräsentative konfokale Bilder der CXCL1-Expression in zerebralen Mikrogefäßen (grün, G) und Neutrophilen (rot, H) in den Seitenventrikeln von APP/PS1-Mäusen, denen BR1-mCdk5 oder BR1-CON über die Schwanzvene injiziert wurde. Maßstabsbalken: 10 μm in G; 50 μm in H. I, J Repräsentative Durchflusszytometrieanalyse und Quantifizierung von Neutrophilen (Ly6Ghi/Ly6Clo) im Gehirn von APP/PS1-Mäusen, denen BR1-Cdk5 oder BR1-CON injiziert wurde (n = 4–5 Mäuse pro Gruppe). K Repräsentative Heatmap der Fluchtbahn in der Sondenphase der MWM-Aufgabe. L BR1-mCdk5- oder BR1-CON-injizierte APP/PS1-Mäuse (8 Monate alt) und altersentsprechende WT-Mäuse wurden in der MWM-Aufgabe bewertet. M, N Die Häufigkeit und Zeit, die in den Gruppen im Zielquadranten (TQ) verbracht wird. O Kontextueller Gefriertest. n = 7 oder 10 Mäuse pro Gruppe für den Verhaltenstest. Alle Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung angezeigt; zweifache wiederholte ANOVA, Bonferroni-Mehrfachvergleichstests; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001.

In Übereinstimmung mit den In-vitro-Ergebnissen war die CXCL1-Expression in Gehirngefäßen nach der Cdk5-Überexpression in APP/PS1-Mäusen verringert, wie durch Immunfluoreszenzfärbung gezeigt (Abb. 6G). Darüber hinaus führte die Überexpression von endothelialem Cdk5 zu einer Verringerung der wandernden Neutrophilen zum Gehirn (Abb. 6H – J), verkürzte die Fluchtlatenz (Abb. 6L) und erhöhte die Häufigkeit der Durchgänge über die Plattform (Abb. 6K, M). und die Dauer im Zielquadranten im MWM-Test (Abb. 6N) und eine längere Einfrierzeit im kontextuellen, aber nicht hinweisbezogenen Gedächtnistest (Abb. 6O). Somit stimmen diese Ergebnisse weitgehend mit den In-vitro-Daten überein und zeigen, dass die Überexpression von Cdk5 die CXCL1-Sekretion in Endothelzellen des Gehirns verringert.

Insgesamt belegen unsere Ergebnisse, dass eine verstärkte Cdk5-Signalübertragung die Infiltration von Neutrophilen hemmt und Gedächtnisdefizite behebt, was auf die vorteilhaften Auswirkungen der Serumbehandlung in einem AD-Mausmodell hindeutet.

Synaptischer Verlust wird bei AD-Patienten in der Regel frühzeitig erkannt [51] und in Mausmodellen der Krankheit [52]. Daher haben wir als nächstes die Wirkung von Serum auf den präsynaptischen Marker Synaptophysin und den AMPA-Rezeptor GluA1 bestimmt. In Übereinstimmung mit früheren Studien (53, 54) zeigte das 8–9 Monate alte männliche APP/PS1-Mausmodell im Vergleich zu Beobachtungen eine signifikante Abnahme der Synaptophysin- und GluA1-Expression im DG und CA3, nicht jedoch im CA1 des Hippocampus bei den altersentsprechenden WT-Kontrollen (Abb. 7A–E; für Synaptophysin Abnahme um 32,6 % bzw. 47,8 % bei DG und CA3; Abnahme um 42,5 % bei CA3 für GluA1). Nach viral induzierter Cdk5-Überexpression stellten wir fest, dass die Abnahme der synaptischen Proteine ​​bei APP/PS1-Mäusen signifikant wiederhergestellt wurde (Abb. 7E, F), was mit den Ergebnissen bei APP/PS1-Mäusen übereinstimmt, die mit Serum und Ly6G-Antikörper behandelt wurden (Ergänzung). Abb. 13A–H). Darüber hinaus wurden in den verschiedenen Gruppen durch Western-Blot-Analyse keine Unterschiede in der GluA1-, Synaptophysin- oder PSD95-Expression im Kortex beobachtet (ergänzende Abbildung 13I, J).

Repräsentative konfokale Bilder (A–D) und Quantifizierung (E) von Synaptophysin und GluA1 in CA1, CA3 und DG im Hippocampus von WT-Mäusen, mit AAV-Cdk5 behandelten APP/PS1-Mäusen und den Kontrollen. IR: Immunreaktivität; Maßstabsbalken, 100 μm. F Western-Blot-Analyse synaptischer Proteine, einschließlich GluA1, PSD95 und Synaptophysin im Hippocampus. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt; einfache ANOVA- und LSD-Mehrfachvergleichstests, n = 4 Mäuse pro Gruppe (mehr als 10 Bildfelder aus 5 Gehirnschnitten pro Tier wurden analysiert und als Wert gemittelt); *p < 0,05; **p < 0,01, ns nicht signifikant. G Schematische Darstellung der Experimente in H–K. H Konfokale Bilder und 3D-Rekonstruktion von Mikrogliafortsätzen (Cx3cr1-GFP), die GluA1+-Puncta verschlingen, wurde der Prozentsatz der von Mikroglia verschlungenen Puncta bewertet. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt; einfache ANOVA- und LSD-Mehrfachvergleichstests, n = 5 Mäuse pro Gruppe (mehr als 34 Mikroglia aus 5 Gehirnschnitten pro Tier wurden analysiert und als Wert gemittelt); *p < 0,05; **p < 0,01. I Verschlungene Puncta, verteilt in Mikroglia, der Abstand beträgt weniger als 0 μm von der Mikrogliaoberfläche; und kontaktierte Puncta, die außerhalb der Mikroglia verteilt sind, der Abstand von der Mikrogliaoberfläche jedoch weniger als 0,25 μm beträgt. Lila Puncta wurden in I (unten) gezeigt. J 3D-Rekonstruktion von Mikrogliafortsätzen und GluA1+-Punkten in WT-Mäusen sowie Aβ-Plaques (blau) in APP/PS1-Mäusen und kontaktierten GluA1-Punkten (weniger als 0,25 μm) wurden analysiert (n = 25–44 Zellen von 7 Mäusen) . K Sholl-Analyse von 3D-rekonstruierten Mikroglia (n = 14–21 Zellen von 3 Mäusen pro Gruppe). *p < 0,05; **p < 0,01. Maßstabsbalken: 1 μm in H, I; 5 μm in J, 10 μm in K. L Repräsentative Spuren von mEPSCs in DG-Pyramidenneuronen von Wide-Type-Mäusen, APP/PS1-Mäusen und APP/PS1-Mäusen, die mit AAV-Cdk5 behandelt wurden, Maßstabsbalken: 1 s, 20 pA. M Durchschnittliche Häufigkeit von mEPSCs. N Durchschnittliche Amplituden von mEPSCs; Kolmogorov-Smirnov-Test; *p < 0,05; ***p < 0,001; n = 19 oder 20 Zellen von 3 Mäusen/Gruppe in M ​​und N.

Mikroglia fördern die Synapsenbeschneidung in komplementabhängiger Weise [52]. Der bei AD-Mäusen beobachtete synaptische Verlust kann auf eine erhöhte mikrogliale Phagozytose zurückzuführen sein [27, 52]. Um zu testen, ob Mikroglia in der vorliegenden Studie direkt mit neuronalen Synapsen interagieren, untersuchten wir die Assoziation von Mikroglia, die fluoreszierende Reporter exprimieren, mit synaptischen Puncta (GluA1+) anhand von 3D-Rekonstruktionsbildern des Hippocampus in APP/PS1-Mäusen (Abb. 7G). Wir haben die GluA1+-Synapsen in zwei Teilmengen eingeteilt: umhüllte Puncta (verteilt innerhalb der Mikroglia mit einem Abstand von weniger als 0 μm von der Mikrogliaoberfläche; gelbe Puncta in Abb. 7H; hellviolette Puncta in Abb. 7I) und kontaktierte Puncta (verteilt außerhalb der Mikroglia mit ein Abstand von weniger als 0,25 μm von der Mikrogliaoberfläche; violette Puncta in Abb. 7I, unten). Unsere Daten zeigten, dass bei Cdk5-überexprimierten APP/PS1-Mäusen eine signifikante Abnahme der synaptischen GluA1+-Spots, die von Cx3cr1GFP-Mikroglia verschlungen oder kontaktiert wurden, wiederhergestellt wurde (Abb. 7H – J). Die Sholl-Analyse zeigte, dass die verringerte Komplexität der Mikroglia-Verzweigung bei APP/PS1-Mäusen durch Überexpression von Cdk5 in Endothelzellen des Gehirns normalisiert wurde (Abb. 7K).

Um weiter zu untersuchen, ob die beeinträchtigte synaptische Funktion bei APP/PS1-Mäusen nach der AAV-Cdk5-Behandlung wiederhergestellt wurde, untersuchten wir die synaptischen Eigenschaften von Pyramidenneuronen im DG. Ganzzellaufzeichnungen von Pyramidenneuronen zeigten, dass die Häufigkeit, aber nicht die Amplitude des spontanen mEPSC bei APP/PS1-Mäusen dramatisch abnahm, wohingegen diese Effekte nach der Überexpression von Cdk5 wieder auf ein breites Niveau zurückkehrten (Abb. 7L – N). Zusammen mit den Daten der GluA1+-Synapse zeigten diese Daten, dass die Überexpression von Cdk5 die reduzierten synaptischen Eingaben in DG-Pyramidenneuronen in APP/PS1-Mäusen wiederherstellte.

Wie erwartet zeigten Mikroglia in APP/PS1-Mäusen, die Isotyp-IgG-Antikörper erhielten, eine amöboide Morphologie, exprimierten hohe Mengen an CD68 und zeigten kleinere Volumina (ergänzende Abbildung 14A – C). Bemerkenswert ist, dass die Behandlung mit Cdk5-Überexpression, Serum und Ly6G-Antikörpern nicht nur die übermäßige Aktivierung von Mikroglia (Iba-1+/CD68+) deutlich linderte, sondern auch die Prozesslänge und das Volumen der Mikroglia teilweise in Richtung der homöostatischen Form verschob (ergänzende Abbildung 14A – F). . Serum veränderte weder die Aβ-Verteilungen (ergänzende Abbildung 15A – D) noch RIPA und SDS-lösliches Aβ40 und Aβ42 im Gehirn (ergänzende Abbildung 15E – L), was darauf hindeutet, dass diese Auswirkungen auf Mikroglia unabhängig von Aβ-Plaques sind. Darüber hinaus identifizierten wir die Phosphor-Tau- und Gesamt-Tau-Spiegel im Gehirn nach der Serumbehandlung, die keinen Einfluss auf die Gesamt-Tau- und Phosphor-Tau-Spiegel sowohl im Hippocampus als auch im Cortex des APP/PS1-Gehirns hatten (ergänzende Abbildung 16A). -D). Darüber hinaus wurden nach Seruminjektion auch Tau-Multimere von 140 kDa (Bande mit hohem Molekulargewicht) gemessen. In ähnlicher Weise blieben die Tau-Werte mit hohem Molekulargewicht im Vergleich zu den Kontrollen unverändert (ergänzende Abbildung 16A – D). Insgesamt zeigten unsere Ergebnisse, dass die Hemmung der Neutrophileninfiltration durch Serum die kognitive Beeinträchtigung verbesserte, teilweise durch Linderung des synaptischen Verlusts und der Neuroinflammation im Hippocampus des APP/PS1-Gehirns.

Das angeborene Immunsystem, einschließlich peripherer Neutrophiler und zentraler Mikroglia, spielt eine wichtige Rolle bei neurodegenerativen Erkrankungen [4, 6, 39, 55]. Neutrophile sind die wichtigsten Effektorzellen der frühen angeborenen Immunität und tragen zur Entzündung im Gehirn [10, 56] und in der Peripherie [6] bei. In dieser Studie haben wir herausgefunden, dass die Seruminjektion die Rekrutierung hyperreaktiver Neutrophilen im Gehirn blockiert und die extravaskulären Neutrophilenfallen (NETs) reduziert, wodurch die Gedächtnisstörung bei AD-Mäusen verbessert wird. Mechanistisch gesehen klärte unsere Studie die Transportmechanismen auf, die der Neutrophileninfiltration im Zusammenhang mit dem Serumfaktor VEGF-A zugrunde liegen, der die endotheliale Cdk5-Aktivität bei der Verringerung der CXCL1-Sekretion im AD-Gehirn vermittelte. Wir haben außerdem gezeigt, dass die Hemmung der Neutrophileninfiltration in das AD-Gehirn durch Serum- und endotheliale Cdk5-Überexpression Gedächtnisdefizite verbesserte, zumindest teilweise durch Reduzierung der Synapsenbeschneidung durch Mikroglia und Erhöhung der synaptischen Aktivität im Hippocampus.

Frühere Untersuchungen zeigten, dass die Blockierung des Ly6G-Signals, eines Neutrophilen-spezifischen Markers, die Migration von Neutrophilen zu vaskulären und neuralen Entzündungsherden verringert [57]. Als Ergebnis konnten wir zeigen, dass die Seruminjektion die Anhaftung von Neutrophilen, insbesondere in der Nähe von Hirngefäßen und Aβ-Plaques, drastisch reduzierte und die Gedächtnisstörung bei AD-Mäusen verbesserte. Darüber hinaus wurden nach der Seruminjektion die Kapillarsegmente des Gehirns wiederhergestellt und die Infiltration von Neutrophilen blockiert, wodurch der Blutfluss und die Perfusion im Gehirn erhöht wurden [10], was die kognitiven Fähigkeiten verbesserte. Die auf den DEPs basierende PPI-Analyse zeigte auch eine vom Serum stammende Zytokin-VEGF-A- und CXCL1-vermittelte Chemotaxis. Konsequenterweise hatte rekombinantes VEGF-A ähnliche Wirkungen wie der Ly6G-Antikörper bei der Blockierung der Neutrophileninfiltration in das AD-Gehirn. Wir kamen daher zu dem Schluss, dass VEGF-A in Wildtyp-Serum die Gedächtnisstörung bei AD-Mäusen verbesserte, was höchstwahrscheinlich auf eine verminderte Neutrophileninfiltration zurückzuführen ist.

Mit zunehmendem Alter nimmt die VEGF-Signalübertragung im Gehirn deutlich ab, während eine zunehmende VEGF-Signalübertragung vor altersbedingtem Kapillarverlust, beeinträchtigter Durchblutung und verminderter Sauerstoffversorgung des Gewebes schützt [22], die auch bei AD-Patienten beobachtet werden [58,59,60]. Darüber hinaus ist VEGF im Liquor mit der Längsgedächtnisleistung verbunden, insbesondere bei Amyloid- und Tau-positiven Personen [61], und VEGF-bedingte Varianten scheinen das Risiko für AD zu beeinflussen [62]. Daher deuten diese Berichte darauf hin, dass die VEGF-Signalübertragung an der Entstehung von AD beteiligt ist. Frühere Studien zeigten, dass die Hemmung der Cdk5-Aktivität in Hypophysenzellen von Ratten die VEGF-A-Expression reduzierte [63, 64], was darauf hindeutet, dass eine zugrunde liegende Verbindung zwischen VEGF-A und Cdk5 im Endothel besteht. Interessanterweise verhinderte rekombinantes VEGF-A in der vorliegenden Studie direkt die Aβ-vermittelte Cdk5-Hemmung, förderte die Endothelzellproliferation in bEnd.3-Zellen und verhinderte den Verlust von Gehirnkapillaren in einem AD-Mausmodell.

CDK5, ein Mitglied der Cyclin-abhängigen Kinase-Familie, reguliert die Proliferation, Migration und Angiogenese von Endothelzellen und ist an den wichtigsten pathologischen Merkmalen von AD beteiligt [65,66,67,68]. In unserer Studie hemmte die endotheliale Cdk5-Überexpression die CXCL1-Sekretion und die Infiltration peripherer Neutrophilen in das AD-Gehirn. Tatsächlich wurde in einer früheren Studie berichtet, dass der endothelspezifische Cdk5-Knockout bei Mäusen zu spontanen Anfällen führte, indem er die CXCL1-induzierte Astrogliose hochregulierte [48]. Zusammen mit den Ergebnissen einer geringeren Cdk5-mRNA-Expression im Hippocampus [69] und einer erhöhten CXCL1-Genexpression in präfrontalen kortikalen Mikrogefäßen von Tau-assoziierten AD-Patienten [70] deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass ein Cdk5-Mangel in Gehirnendothelzellen die CXCL1-Sekretion fördert [71]. . Somit zeigt unsere Studie, dass aus Serum gewonnenes VEGF-A die CXCL1-Sekretion unterdrückt, indem es die Cdk5-Aktivität moduliert und dadurch die Migration von Neutrophilen in das Gehirn verhindert.

Über die Interaktion von Neutrophilen und Mikroglia wurde in einem LPS-induzierten Entzündungsmodell unter Verwendung der Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie berichtet [72]. Darüber hinaus rekrutieren von Mikroglia abgeleitetes IL-1β und das Chemokin CXCL1 Neutrophile in einem mit Pilzen infizierten ZNS auf eine vom Syk-Adapter CARD9 abhängige Weise [45]. Hier zeigten wir, dass die Mikroglia-Aktivierung und der synaptische Verlust durch Serum, endotheliale Cdk5-Überexpression oder Blockade der Neutrophileninfiltration verhindert wurden. Somit können Neutrophile proinflammatorische Signale liefern, um das Beschneiden von Mikroglia in einem AD-Mausmodell zu fördern. Interessanterweise haben wir in einem AD-Mausmodell gezeigt, dass infiltrierende Neutrophile NETs in mehreren Gehirnbereichen freisetzten, was durch Anti-Ly6G-Antikörper und Serumbehandlung verhindert wurde. Diese Interaktion könnte einen faszinierenden Mechanismus für die NET-vermittelte Mikroglia-Aktivierung und Beschneidung neuronaler Synapsen darstellen [73]. Zukünftige Studien sind erforderlich, um die Rolle von Neutrophilen produzierenden NETs bei der Aktivierung von Mikroglia und der synaptischen Beschneidung in einem AD-Mausmodell zu untersuchen.

Wichtig ist, dass wir zuvor gezeigt hatten, dass die Rekrutierung von Monozyten im Gehirn über die Immunaktivierung positive Auswirkungen auf AD haben könnte [27, 74, 75]. In der aktuellen Studie stellten wir fest, dass die Neutrophileninfiltration im Gehirn von APP/PS1-Mäusen signifikant verringert war, obwohl die peripheren Monozyten nach der Serumbehandlung erhöht waren, und nicht die Monozyten/Makrophagen. Aus diesem Grund konzentrieren wir uns speziell auf die entscheidende Rolle infiltrierender Neutrophiler bei AD-Pathologien. Die Blutverjüngung könnte auch die Expression verschiedener Gene, die an neuronalen Signalwegen beteiligt sind, in Richtung normaler Werte modulieren. Beispielsweise gibt es in jungem Plasma systemische Faktoren, die für den therapeutischen Nutzen notwendig sind, einschließlich der Aktivierung des Notch-Signals in Abhängigkeit von der Regeneration [76], der Wiederherstellung des Signalwegs des Wachstumsdifferenzierungsfaktors 11 [12, 77] und der Hochregulierung des Oxytocinspiegels [78]. Aktivierung des zyklischen AMP-Response-Element-Bindungsproteins.

VEGF-A ist ein neuroprotektives Zytokin, das die Neurogenese und Angiogenese im Gehirn fördert [79, 80]. Wir lieferten übereinstimmend Beweise dafür, dass Serum den unzureichenden zirkulierenden VEGF-A-Spiegel bei AD-Mäusen rettete. Rekombinanter VEGF-A förderte die Endothelzellproliferation in vitro und verhinderte den Kapillarverlust in vivo. Daher kann VEGF-A wichtig sein, um die zerebrale Durchblutung und den Blutfluss für ausreichend Blutsauerstoff zu verbessern, insbesondere im Alter [22, 79] und bei der Alzheimer-Krankheit [81]. Daher könnte die endotheliale VEGF-A/Cdk5-Signalübertragung eine potenzielle therapeutische Strategie zur Verbesserung der AD-Pathologie durch Regulierung der Neutrophileninfiltration sein.

Zusätzlich zu VEGF-A können auch andere angereicherte Blutfaktoren wie VCAM1, HGF und Clusterin, die an der Funktion vaskulärer Endothelzellen beteiligt sind, die Gehirnfunktionen verbessern. Tatsächlich wirkt ein Mangel an endothelialen VCAM1-Genen im Gehirn den schädlichen Auswirkungen von gealtertem Plasma auf junge Gehirne entgegen, einschließlich der Mikroglia-Reaktivität und der Gedächtnisfunktion [16]. Kürzlich wurde gezeigt, dass HGF positive Auswirkungen auf die Hippocampus-Neurogenese und die kognitive Funktion bei SAMP8-Mäusen hat, einem weiteren Mausmodell für AD [82]. Clusterin, ein Komplementkaskadeninhibitor, kann an Endothelzellen des Gehirns binden und die Neuroinflammation bei mThy-1-hAPP751-Mäusen reduzieren [83]. Ob andere Serumfaktoren mit VEGF-A zusammenarbeiten, ist noch unbekannt, aber unsere Arbeit erweitert die Anwendung blutübertragener Faktoren zur Wiederherstellung der AD-Gehirnfunktionen. Eine gezieltere oder kombinierte Therapie mit Serumfaktoren erfordert weitere Studien.

VEGF hat umfassende Funktionen in mehreren Signalwegen in einer Vielzahl von Zelltypen. Beispielsweise kehrte die Blockierung der Wirkung von VEGF auf Astrozyten den BHS-Abbau um [84], während die Hemmung der luminalen VEGF-Signalisierung die BHS-Integrität und den zerebralen Blutfluss erhöhte und die Kapillardichte bei APP/PS1-Mäusen verringerte [85]. In dieser Studie haben wir beobachtet, dass eine niedrig dosierte VEGF-A-Injektion die Gehirnkapillardichte im gleichen Stamm des AD-Mausmodells wiederherstellte, was mit den Daten übereinstimmt, die zeigen, dass die Anti-VEGF-Behandlung in Alis Arbeit die Kapillardichte verringerte. Allerdings wurden in unserem AD-Mausmodell nach der VEGF-A-Injektion keine signifikanten Veränderungen der BHS-Integrität und -Permeabilität beobachtet. Der mögliche Grund ist, dass das von uns verwendete APP/PS1-Mausmodell (8 Monate) jünger ist als die in Alis Studie verwendeten Tiere (10–14 Monate). Eine alternative Erklärung ist, dass es nach einer niedrig dosierten VEGF-A-Behandlung zu einem vorübergehenden Anstieg der BHS-Permeabilität kommen kann, der innerhalb weniger Stunden wiederhergestellt werden kann [86]. Daher wurden die Durchlässigkeit und Integrität der Blut-Hirn-Schranke bei VEGF-A-behandelten APP/PS1-Mäusen verständlicherweise nicht weiter verschlechtert.

Darüber hinaus wurde festgestellt, dass viele zirkulierende Proteine ​​an der Regulierung der BHS-Permeabilität beteiligt sind, wie z. B. Endothelin-1 (EDN1) und Fibrinogen (FG), von denen berichtet wurde, dass sie im frontalen Kortex von AD-Patienten erhöht sind [87]. Daher muss die besondere Rolle von VEGF-A bei der BHS-Permeabilität, der Kapillardichte und dem Blutfluss in Abhängigkeit von Zelltypen, Krankheitsmodellen und Krankheitsstadien geklärt werden. Darüber hinaus blieb die Frage, ob 8 Monate altes Serum die gleichen positiven Auswirkungen auf AD haben könnte wie 4–6 Monate altes Serum, immer noch ungelöst. Es handelt sich um eine Einschränkung in der vorliegenden Studie, die in Zukunft behoben werden muss.

Es wurde vorgeschlagen, dass durch Blut übertragene Faktoren von Jungtieren oder Trainingsserum/-plasma die Gehirnfunktionen, einschließlich Neurogenese, synaptische Plastizität und Entzündung, sowie Lernen und Gedächtnis sowohl bei alten Tieren als auch in AD-Mausmodellen fördern. Daher muss die Anwendung von Blutfaktoren bei anderen neurodegenerativen Erkrankungen in Betracht gezogen werden. Unsere Daten liefern Hinweise darauf, dass die endotheliale VEGF-A/Cdk5-Signalübertragung Neutrophilentransportmoleküle vermittelt, was unterstreicht, dass endotheliales VEGF-A/Cdk5 im Gehirn als potenzielles therapeutisches Ziel für die Alzheimer-Krankheit dienen könnte (Abb. 8).

Die vorgeschlagene Rolle der endothelialen VEGF-A/Cdk5/CXCL1-Signalisierung im Prozess der Neutrophileninfiltration in das Gehirn bei AD-Mäusen. Aus Wildtyp-Serum gewonnenes VEGF-A unterdrückt die Expression von CXCL1 im vaskulären Endothel des Gehirns durch Hochregulierung der Cdk5-Aktivität, wodurch die Rekrutierung von Neutrophilen im Gehirn bei AD-Mäusen gestoppt und die Gedächtnisstörung verbessert wird. VEGF-AR VEGF-A-Rezeptor, CXCR2 CXC-Motiv Chemokinrezeptor 2.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Frau Lin Zhang, Dr. Hongyang Zhang und Bs. Zhenyan Yu für ihre freundliche Unterstützung. Wir danken auch Frau Qunfang Yuan und Dr. Juntao Zou für die Vorschläge für Experimente im Zusammenhang mit der angeborenen Immunität. Wir danken der Core Lab Platform for Medical Science der Zhongshan School of Medicine der Sun Yat-sen University.

Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation of China (82271473, 81971021, 81901339, 82172547 und 82172636), den Fundamental Research Funds for the Central Universities (19ykpy99) und dem Science Innovation 2030-Brain Science and Brain-Inspired Intelligence Technology Major unterstützt Projekt (2021ZD0201100 und 2021ZD0201102), das Guangzhou Science and Technology Planning Project (202002030441) und die Natural Science Foundation der Provinz Guangdong, China (2019A1515011184, 2020A151501001).

Fangfang Qi

Aktuelle Adresse: Abteilung für Neurologie, Mayo Clinic, Rochester, MN, 55905, USA

Diese Autoren trugen gleichermaßen bei: Fangfang Qi, Zejie Zuo, Kaishun Hu, Shengwen Wang, Long-Jun Wu, Kaihua Guo.

Abteilung für Anatomie und Physiologie, Schlüssellabor für Gehirnfunktion und -krankheit der Provinz Guangdong, Zentrum für fortgeschrittene medizinische Technologie, The First Affiliated Hospital, Zhongshan School of Medicine, Sun Yat-sen University, Guangzhou, 510080, China

Fangfang Qi, Rui Wang, Tong Wu, Hao Liu, Jiaoling Tang, Qingbo Wang, Yunjie Yang, Jie Xu, Zhibin Yao und Kaihua Guo

Redaktionsabteilung des Journals der Sun Yat-sen University, Guangzhou, 510080, China

Fangfang Qi

Abteilung für Rehabilitationsmedizin, Drittes angegliedertes Krankenhaus, Sun Yat-sen-Universität, Guangzhou, 510630, China

Zejie Zuo

Schlüssellabor der Provinz Guangdong für Epigenetik und Genregulation bösartiger Tumoren, gemeinsames Labor Guangdong-Hong Kong für RNA-Medizin, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou, 510120, China

Kaishun Hu

Fünfjährige Programme für klinische Medizin in der Klasse 2017, School of Medicine, Sun Yat-sen University, Shenzhen, 528406, China

Yufeng Xie

Abteilung für Neurologie, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou, 510120, China

Liren Tan

Zentrum für Stammzellbiologie und Gewebetechnik, Schlüssellabor für Stammzellen und Gewebetechnik, Bildungsministerium, Sun Yat-sen-Universität, Guangzhou, 510080, China

Xiaoran Zhang

Abteilung für Neurologie, Mayo Clinic, Rochester, MN, 55905, USA

Jiaying Zheng & Long-Jun Wu

Abteilung für Neurochirurgie, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou, 510120, China

Shengwen Wang

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KG, KH, L-JW und FQ trugen zum Design dieser Studie und zur Analyse der Daten bei. SW, L-JW und FQ haben das Manuskript geschrieben. FQ, SW, ZZ, RW, YX, HL, JT und TW führten die meisten Experimente durch, darunter Verhaltensbewertung, konfokales Laser-Scanning-Mikroskop und biochemische Experimente. XZ und QW verabreichten Serum. LT führte die Experimente in vitro durch. Alle übrigen Autoren beteiligten sich an der Generierung der Originaldaten und gaben eine kritische Bewertung des Manuskripts ab. Alle Autoren stimmten dem endgültigen Manuskript zu.

Korrespondenz mit Shengwen Wang, Long-Jun Wu oder Kaihua Guo.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Qi, F., Zuo, Z., Hu, K. et al. VEGF-A im Serum schützt vor Gedächtnisstörungen bei transgenen APP/PS1-Mäusen, indem es die Infiltration von Neutrophilen blockiert. Mol Psychiatrie (2023). https://doi.org/10.1038/s41380-023-02097-w

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Eingegangen: 28. Juli 2022

Überarbeitet: 17. April 2023

Angenommen: 27. April 2023

Veröffentlicht: 06. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41380-023-02097-w

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